注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Eosin B肉桂酸 standard for GC,>99.5% (GC) 細(xì)胞色素C 95%

Eosin Y sodium salt water soluble肉桂酸 AR，99%DNA酶 ≥300 Kunitz units/mg protein

Eosin Y free acid alcohol soluble肉桂酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品DNA酶 ≥2,000 Kunitz units/mg protein

Oil red O肉桂 98%彈性蛋白酶 30 units/mg

Ponceau S肉桂 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>99.5%（GC)透明質(zhì)酸酶 ≥ 300 IU/mg

Methylene Blue trihydratee肉桂酸 ≥99.0%, FG辣根過氧化物酶 RZ：>3.0，活性：>250 IU/mg

TBPB肉桂酸 天然, ≥99%, FCC辣根過氧化物酶 RZ：>2.5，活性：>200 IU/mg

Evans blue香茅  85%,FCC辣根過氧化物酶 RZ：>2.0，活性：>160 IU/mg

INT香茅  96%RZ：1.5 RZ：>1.5，活性：>100 IU/mg

NBT肉桂 98%辣根過氧化物酶 RZ：>3.0，活性：>300 IU/mg

Indigo肉桂 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>99%（GC)核糖核酸酶 ≥ 50 Kunitz units/mg

Indigo carmine正癸 Standard for GC,≥99.5% (GC)胰蛋白酶（牛胰臟） potency ≥2500 units/mg

Thymol blue正癸 98%鄰甲酚 99%

Thymol Blue sodium salt琥珀酸二乙酯 98%間甲酚 99.7%，無色

BPB琥珀酸二乙酯 99%間甲酚  Standard for GC,≥99.7%(GC)

Bromophel blue sodium salt琥珀酸二乙酯 standard for GC, ≥99.6% (GC)間甲酚 CP

紅霉酮(特利霉素)Protor-2 (D19A5) Rabbit mAbReprimo  細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的糖基化蛋白抗體

替米沙坦RCAS1 (D2B6N) XP® Rabbit mAbRepetin  中間絲相關(guān)蛋白抗體

替米沙坦（標(biāo)準(zhǔn)品）RCAS1 (D2B6N) XP® Rabbit mAbRENT1/hUPF1  ATP依賴解旋酶RENT1抗體

rotein A (HRP Conjugate)Renin  腎素/血管緊張素形成酶Ren1抗體

（標(biāo)準(zhǔn)品）TEAD1 (D9X2L) Rabbit mAbRENBP  腎素結(jié)合蛋白抗體

噻托溴銨一合物ATP2A1/SERCA1 (D54G12) Rabbit mAbRenalase  腎胺酶抗體

鹽酸胺酮CUEDC2 AntibodyREM/GTP binding protein REM1  GTP結(jié)合蛋白R(shí)EM1抗體

鹽酸胺酮（標(biāo)準(zhǔn)品）FXR1 (D10A2) XP® Rabbit mAbRELN/Reelin  絡(luò)絲蛋白抗體

阿莫曲普坦蘋果酸鹽FXR1 (D10A2) XP® Rabbit mAbRELMa/RELM alpha  抵抗素樣分子α抗體

阿糖腺苷PKR (D7F7) Rabbit mAbRELM beta/CCGR  結(jié)腸癌相關(guān)基因蛋白抗體
桔青霉PCR檢測試劑盒說明書人可溶性凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(sLOX-1)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1公斤

人可溶性瘦素受體(sLR)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃1克

人可溶性髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1(sTREM-1)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量： 保存-20℃1毫克

人可溶性細(xì)胞間粘附分子1(sICAM-1)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1克

人可溶性細(xì)胞因子受體(sCKR)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：500毫升

人可溶性腺苷酸環(huán)化酶(sAC)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：500毫升

人可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2/sFLK-1)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：保存：-20℃25毫克

人可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(sEPCR)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：10毫升
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。